增材制造，通常被稱為3D打印，在組織工程領域因其能夠制造具有復雜三維和可定制幾何形狀的合成生物相容性支架而受到了顯著關注。這些支架能夠有效地支持細胞生長和組織形成，其中材料擠出、材料噴射和槽式光聚合在內的3D打印技術已被用于支架的制造。目前，生物打印技術可以直接3D打印細胞，這些細胞被嵌入水凝膠墨水中，能同時保持與解剖結構相似的空間布局。盡管增材制造在支架制造方面取得了快速進展，但仍存在一些挑戰。尤其是在單個制造模式中實現部件大小、打印分辨率、尺寸范圍、結構穩定性和生物相容性之間的平衡仍然難以實現。例如，常用的基于注射器的制造方法（如熔融沉積建模和3D生物打印）在制造精度和分辨率方面仍不及其他增材制造技術。雙光子聚合在制造精度和分辨率上達到了很高的水平，使得細胞水平上的支架交互成為可能，但它仍面臨制造效率和構建體積的限制，通常構建體積小于1 mm3。相比之下，立體光刻和槽式聚合技術在擴大制造規模、提高精度和分辨率方面展現出潛力，但它們所采用的光固化環氧樹脂作為打印材料，往往對細胞的生物相容性和毒性等方面都表現不佳。

碳，在生物材料支架和生物制造領域展現出巨大的潛力，這得益于其出色的生物相容性、化學穩定性以及可調節的機械和電氣特性。在不同的碳同素異形體中，碳納米管（CNTs）和石墨烯已經成為了非聚合物組織工程支架材料中的熱門選擇，這些材料中還展示了骨骼肌細胞的培養的可能性。然而，由于CNTs和石墨烯的納米材料性質，這些材料不能直接進行增材制造。傳統的3D碳材料結構化方法涉及使用基于模板的方法，可在3D多孔模板上生長或沉積碳納米材料，然后通過腐蝕去除模板材料。這種方法的缺點是3D碳材料的形狀受到支架材料特性的限制。作為替代方案，CNTs和石墨烯可以被整合到聚合物基質中以促進直接3D打印。然而，聚合物復合材料可能會損害原始石墨烯或CNTs的固有生物響應。

此外，將石墨烯或CNTs整合到聚合物基質中主要應用于基于擠出的3D打印，如前所述，這種方法在打印精度和分辨率方面存在不足，通常限制了細胞3D定殖。為了實現與所需組織工程應用相匹配的結構分辨率的3D打印純碳，結構化聚合物前體的熱解提供了一種可行的解決方案。通過結合不同的增材制造過程和后續的熱解過程，已經證明在不同的長度尺度上可以實現3D結構化熱解碳（PyC）的可行性。例如，雙光子聚合可以制造出具有分辨率高達數百納米的3D結構的PyC。相比之下，立體光刻3D打印的結構尺寸可以從亞100微米到幾毫米。然而，將3D結構的PyC作為細胞3D生長支架的應用仍未被探索。一些研究表明，在骨骼組織工程中使用3D結構的PyC結構具有前景。然而，這些研究中的孔隙大小（>300 μm）在元素之間顯著較大，仍然限制了實現細胞3D定殖。

基于此，來自海德堡大學的研發團隊設計了一種可變形3D結構的PyC作為潛在的生物材料支架，并研究了它們與骨骼肌細胞的相互作用，以實現細胞的三維培養。該研究以“Microarchitected Compliant Scaffolds of Pyrolytic Carbon for 3D Muscle Cell Growth"發布在國際期刊《Advanced Healthcare Materials》。

在本研究中，團隊使用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術（nanoArch® S130，精度：2 μm）制備出主要結構，隨后通過熱解實現了具有與骨骼肌細胞相當可變形PyC支架的尺寸特征。盡管在組織工程應用中通常使用固定的剛性支架，該研究團隊還將開發一種新穎的概念，用于制造可變形的PyC支架。在這里，“形狀變形"指的是結構通過機械或手動操作改變其空間排列的能力。需要注意的是，PyC本質上具有脆性，限制了其自然形狀變形的潛力。為了克服這一挑戰，團隊采用了基于可變形機制設計的方法，以實現PyC結構的可變形能力。

PyC結構熱解過程由于前驅體樹脂的熱化學分解釋放氣態化合物而導致顯著的幾何收縮。這種收縮使得PyC晶格厚度可以明顯小于制造能力，例如，設計晶格厚度為15微米的結構在熱解后PyC晶格厚度為4.1 ± 0.4 μm。收縮程度取決于前驅體的晶格厚度和熱解溫度。氣態副產物的釋放通過從表面排氣，因此，較高的表面積導致較高的排氣程度。較小的晶格厚度提供了較高的表面積與體積比，導致較高的收縮程度，例如，當最終熱解溫度為900°C，設計晶格厚度從15到150 μm的收縮率為73 ± 3%到60 ± 2%。另一方面，將熱解溫度從500°C增加到900°C，對于150 μm的晶格厚度，收縮程度從50 ± 3%增加到60 ± 2%。收縮的溫度依賴性主要歸因于溫度范圍內的質量損失。

熱解碳本質上是剛性和脆性的。由于其固有的剛性，改變PyC材料的幾何形狀具有挑戰性，幾乎是不可能的。為了解決這一挑戰，團隊采用了基于可變形機制設計的方法。設計了具有鉸鏈的幾何結構，其中單元通過涉及環形環和軸的控制間隙的旋轉關節連接，從而具有可變形特性，并通過這些旋轉關節實現形狀變化的能力。

然后，研究團隊在3D打印熱解后的PyC支架中培養了C2C12細胞，以評估其生物相容性和細胞生長的能力。C2C12細胞通常被用作肌肉研究的模型細胞，因為它們具有單核和梭形的成肌細胞，這些細胞后來分化為多核的肌管，模仿體內肌肉纖維的形成過程。通過甲基噻唑藍溴化物（MTT）代謝活性和細胞間接接觸PyC材料的活死染色，團隊檢查了PyC支架的生物相容性，圖5b顯示了500°C、700°C和900°C的PyC結構使用MTT試驗的結果，表明所有結構都是生物相容的。團隊還對骨骼肌細胞間接接觸結構進行了活死染色，以進一步研究PyC材料的生物相容性。用鈣黃綠素/碘化丙啶染色后，測量了活細胞與死細胞的比率，并繪制在圖5a中，用于不同熱解溫度獲得的PyC支架，在結構上并沒有看到對肌肉細胞的毒性跡象。

肌動蛋白纖維顯著影響細胞內的運動能力、細胞附著和機械性能。因此，團隊研究了C2C12細胞在碳格上的細胞骨架排列。圖5c–h中phalloidin的熒光圖像揭示了細胞骨架中密集的絲狀肌動蛋白束。細胞主要覆蓋了結構的邊緣。培養的細胞中的肌動蛋白纖維似乎在細胞骨架中隨機分布。有趣的是，經過七天的培養，孔隙中至少填充了43 μm深的骨骼肌細胞，這表明實現了3D定殖，這對于許多組織工程應用是至關重要的。細胞3D定殖進一步通過SEM調查得到證實。圖5i–k展示了經過22天細胞培養的生物混合構建的SEM圖像。細胞覆蓋了PyC支架，并表現出延長的形態，這表明細胞在PyC表面上的優先生長。此外，觀察到細胞在孔隙中生長，并在孔隙上橋接，表明PyC支架支持3D骨骼肌細胞生長。

骨骼肌細胞支架的關鍵標準之一是它們誘導成肌管形成的能力，成肌管是由成肌母細胞融合產生的多核纖維結構。 因此，團隊通過分析Hoechst和phalloidin染色的細胞核和肌動蛋白纖維的熒光，研究了PyC支架誘導成肌管形成的能力。圖6展示了在不同熱解溫度下制備的PyC支架上形成非常少的成肌管。此外，團隊還在PyC支架上進行了熒光研究，以研究形成的肌動蛋白。這些結果表明，在不同溫度下PyC支架上都形成了成肌管，并且它們在支架表面很好地發育并隨機定向。

在3D支架中，細胞遷移和增殖，向內延伸以最終封閉或橋接孔隙，形成類似組織的片狀結構。細胞的集體行為，包括在3D結構中傳播時的速度和最終形狀的橋，取決于孔隙的幾何形狀和大小。例如，在發展的界面上細胞擁擠或展開取決于初始基質是凹的還是凸的。為了更廣泛地探索C2C12細胞與可變形的PyC結構之間的相互作用，細胞被培養在PyC鏈結構上，這些結構為3D細胞生長提供了各種幾何形狀。通過實驗可以看到，細胞覆蓋了整個鏈結構，包括格構件之間的間隙甚至旋轉關節內。細胞被觀察到以平坦的片狀而不是聚集體的方式排列，在這些片狀中形成了多個細胞層。隨后，它們利用細胞間連接橋接孔隙，跨越相當大的距離并有效地填充孔隙。

綜上，研究團隊展示了微型結構熱解后的碳結構用于骨骼肌細胞的3D細胞生長。團隊通過利用摩方精密PμSL技術制造樹脂微型結構，然后進行熱解得到3D結構的PyC。除了典型的固定和剛性的3D結構的PyC外，團隊還采用了一種新的設計方法制造了新的可變形3D結構的Pyc。在細胞培養過程中，C2C12骨骼肌細胞表現出對PyC材料的強烈親和力，顯示出良好的生物相容性和細胞增殖。細胞在剛性和可變形的PyC支架中定殖，行成真正的3D細胞定殖。3D結構的PyC進一步導致培養的肌肉細胞中的肌動蛋白纖維沿可變形結構的良好排列。在PyC結構表面也形成了大量成肌管，其形成依賴于與熱解溫度相關的PyC剛度。然而，PyC材料的成肌分化能力在這里并未全部實現，這需要進一步的廣泛研究。

本研究的結果對于利用3D打印的熱解碳結構作為細胞支架具有重要意義，3D結構的PyC對細胞的親和力可能為多功能支架的設計提供新的視角。